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永利网99007770nm发明单细胞拉曼耦合培养技术(scRACS-Culture) 高效挖掘微生物组资源

  微生物组是自然界最基本、最宝贵的生物资源之一,其代谢功能直接影响着人体微环境与地球大环境的健康。因此,从微生物组中挖掘“特定代谢功能”的活体菌株资源,以保护和修复各种微生态系统,一直是业界孜孜以求的目标。近日,永利网99007770nm与青岛星赛生物等合作发明了单细胞拉曼耦合培养技术(scRACS-Culture),建立了直接从环境样品出发、针对“原位”代谢功能、单细胞精度、免培养、免荧光标记的活体功能菌株挖掘仪器体系;进而联合青岛张村河水务有限公司、永利网99007770nm厦门城市环境研究所、自然资源部第一海洋研究所等,示范了城市污水处理系统中解磷菌的高效挖掘。这一“先筛后养”的scRACS-Culture体系,突破了目前“先养后筛”传统范式的原理性局限,为微生物组功能探测与资源挖掘提供了原创的仪器装备,相关成果发表于ISME Communications。
  
  基于“先筛后养”的策略,单细胞拉曼耦合培养技术和仪器体系(scRACS-Culture)能够全面高效地挖掘微生物组资源 
  长期以来,从环境乃至人体生态系统中识别与获取活体功能菌株资源,主要遵循“先养后筛”的思路,这导致了三个原理性缺陷。第一,功能筛选的“片面性”:由于该思路中纯培养是功能筛选的前提条件,因此筛选的对象仅限于通常仅占菌群物种多样性中很小比例的可培养微生物。第二,功能评价的“失真性”:该思路通常评价的是纯培养后、实验室条件下的功能,而不是最为关键、真正重要的“原位”功能,而前者与后者经常迥异。第三,菌株培养的“盲目性”:该思路目标通常是从菌群中培养出所有细胞,而不是有靶向性地针对目标功能细胞进行培养,导致大量资源浪费于非目标功能细胞的培养上。
  为了克服这三个原理性缺陷,单细胞中心荆晓艳高级工程师和公衍海助理研究员带领的研究小组,基于单细胞中心提出的元拉曼组原理和青岛星赛生物的单细胞拉曼光镊分选仪器,发明了菌群中功能单细胞“先筛后养”的新策略。首先,从环境样品中,不经培养而直接根据单细胞拉曼光谱来识别具特定“原位”代谢功能的目标微生物细胞;其次,基于能够高度保持细胞活性的“液相单细胞拉曼分选耦合培养芯片”(RAGE-Culture芯片),根据拉曼光谱来高效地分选出这些目标细胞,并对接与代谢表型组信息一一对应、每孔一个细胞(One-Cell-One-Tube)的并行化单细胞培养,从而完成基于“原位”代谢功能的活体功能菌评价和获取。此外,上述拉曼分选出来的功能单细胞也可以和“液相单细胞拉曼分选耦合核酸扩增芯片”(RAGE-Seq芯片)对接,实现高覆盖度(可高达100%)的单细胞基因组测序,支撑完整、精准的全基因组代谢重建。
  磷既是维持作物种植、养活全球人口的关键营养元素,也是造成水体污染的重要原因。水体及土壤中的磷源包括可溶磷和不可溶磷(包括无机不可溶磷源和有机不可溶磷源),其中只有可溶态磷能够被生物利用。而解磷菌能够把不可溶磷转化为可溶解态磷源,因此,挖掘在水体、土壤等环境中“原位”行使解磷功能的微生物,具有重要的研究意义和产业价值。为了识别污水微生物组中的原位解磷菌,研究小组利用以Ca3(PO4)2为唯一无机磷源或以卵磷脂为唯一有机磷源的污水样本(预先去除可溶性磷源),结合D2O孵育,从而通过单细胞拉曼光谱中C-D特征峰的强弱,在单细胞精度定量表征污水中微生物的解磷活性,进而建立了原位解磷菌的单细胞识别-分选-培养流程。运用这一scRACS-Culture体系,研究小组在青岛张村河水务有限公司的污水处理池中,原位识别、分选和培养出了Comamonas spp.、Acinetobacter spp.、Enterobacter spp.和Citrobacter spp.等高效原位有机解磷菌。重要的是,其原位解磷活性均比实验室纯培养条件下高出一到两倍,凸显了“先筛后养”策略对菌株“原位”功能认知与评价的重要意义。
  同时,研究人员运用scRACS-Seq,还发现了一类在污水中原位高效溶解不可溶有机磷源、在实验室条件下尚难以纯培养的解磷菌新类群Cutibacterium spp.。精确到一个细菌细胞的高覆盖度基因组重建表明,它们通过分泌金属磷酸酯酶(MPP)、细胞壁锚定5’-核苷酸酶(ushA编码)和质膜定位的PstSCAB-PhoU转运系统,来高效溶解和清除污水中的胞外磷酸盐。
  由于scRACS-Culture的功能筛选不依赖于细胞纯培养,因此能基于“原位”功能、针对菌群中所有的生物多样性进行挖掘,并精准聚焦于目标功能细胞进行培养条件优化。这些特色克服了功能筛选片面性、功能评价失真性、菌株培养盲目性这三个传统“先养后筛”策略的潜在缺陷。
  除了免培养、无需荧光标记、活体表征等特色,单细胞拉曼光谱还具有信息丰富的优势,能“全景式”地刻画底物代谢、产物合成、环境应激等代谢表型组,还可区分微生物细胞或肿瘤细胞的种类,因此scRACS-Culture对于人体、动植物和微生物细胞资源产业具有共性方法学意义。下一步,研究人员将基于流式拉曼分选仪FlowRACS,开发高通量的scRACS-Culture/Seq技术体系,服务于规模化的生命暗物质功能探测和资源挖掘。
  该工作由永利网99007770nm单细胞中心徐健研究员和马波研究员主持,与青岛张村河水务有限公司荆玉姝高级工程师、牟润芝部长、永利网99007770nm厦门城市环境研究所崔丽研究员、自然资源部第一海洋研究所曲凌云研究员等合作完成。该工作得到了国家重大科学仪器研制项目、国家重点研发计划、国家自然科学基金等的支持。(文/荆晓艳 图/刘阳) 
  原文链接:https://doi.org/10.1038/s43705-022-00188-3
  Xiaoyan Jing#, Yanhai Gong#, Huihui Pan, Yu Meng, Yishang Ren, Zhidian Diao, Runzhi Mu, Teng Xu, Jia Zhang, Yuetong Ji, Yuandong Li, Chen Wang, Lingyun Qu, Li Cui, Bo Ma*, Jian Xu*. Single-cell Raman-activated sorting and cultivation (scRACS-Culture) for assessing and mining in situ phosphate-solubilizing microbes from nature. ISME Communications, 2022. 
  

 


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